Cell Metab.｜复旦大学储以微、骆菲菲团队：Foxp3改造CAR-T，从「能量危机」到「代谢续航」的实体瘤治疗新路径

英文标题：Foxp3 confers long-term efficacy of chimeric antigen receptor-T cells via metabolic reprogramming

中文标题：Foxp3通过代谢重编程赋予嵌合抗原受体T细胞长期疗效

发表期刊：Cell Metabolism

影响因子：27.7

客户单位：复旦大学生物医学研究院/基础医学院、复旦大学附属华山医院

百趣提供服务：经典脂质组

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor-T, CAR-T)免疫疗法在血液癌症治疗中效果显著，但用于实体瘤治疗时面临困境。肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)的低氧和营养匮乏致使CAR-T细胞耗竭，限制了治疗效果。调节性T细胞(Regulatory T Cells, Tregs)可在TME中生存和发挥作用，其代谢模式独特，Foxp3作为Tregs的关键转录因子，对维持Tregs代谢和功能意义重大。因此，探究将Tregs代谢优势引入CAR-T细胞，借助调控其代谢来克服TME障碍、防止细胞耗竭，有望提升CAR-T细胞在实体瘤治疗中的疗效。

1、CAR-T_Foxp3细胞获得了与CAR-T_Conv细胞不同的代谢特征

研究者为探究Foxp3过表达对CAR-T细胞代谢的影响，选用具有更强扩增能力和持久性的第三代CAR。通过激活健康供体的人T淋巴细胞，分别用GPC3-CAR感染得到常规的 GPC3-CAR-T(CAR-T_Conv)细胞，用GPC3-CAR和Foxp3共同感染培育出GPC3-CAR-T_Foxp3(CAR-T_Foxp3)细胞（图1A）。

在检测细胞代谢参数时发现，GPC3蛋白刺激后，CAR-T_Foxp3细胞的细胞外酸化率(Extracellular Acidification Rate, ECAR)和耗氧率(Oxygen Consumption Rate, OCR)低于CAR-T_Conv细胞（图1B）。利用LC-MS评估[U-C13]葡萄糖和[U-C13]谷氨酰胺代谢通量，结果显示，CAR-T_Foxp3细胞从[U-C13]葡萄糖产生的相关代谢产物低于CAR-T_Conv细胞，且谷氨酰胺进入三羧酸(Tricarboxylic Acid, TCA)循环的量减少，相关代谢产物水平也更低（图1C-F）。添加丙酮酸也无法恢复CAR-T_Foxp3细胞降低的ECAR和OCR。同时，CAR-T_Foxp3细胞内ATP水平更低，NAD/NADH比值更高，表明其糖酵解和氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation, OXPHOS)适度下调（图1G）。

进一步利用非靶LC-MS筛选，发现CAR-T_Foxp3细胞中与脂质和氨基酸代谢相关的代谢物表达有差异，涉及甘油磷脂代谢等多条途径。脂质组学及BODIPY染色证实，CAR-T_Foxp3细胞甘油三酯水平和细胞内脂滴含量增加（图1H-I）。用二氯乙酸钠(Sodium Dichloroacetate, DCA)处理后，CAR-T_Foxp3细胞脂滴含量降低，暗示Foxp3介导的OXPHOS减少与脂质代谢上调有关（图1I）。同时，CAR-T_Foxp3细胞线粒体膜电位和质量降低，线粒体功能改变（图1J） 。综上，CAR-T_Foxp3细胞的代谢特征与调节性T细胞(Tregs)相似，与CAR-T_Conv细胞不同。

2、CAR-T_Foxp3细胞的代谢特征由Foxp3与Drp1的结合所决定

研究者探究CAR-T_Foxp3细胞代谢模式与Foxp3和线粒体动力学相关蛋白的关系，发现其代谢重编程由Foxp3与Drp1的结合介导。

探究Foxp3与线粒体动力学相关蛋白的相互作用：鉴于CAR-T_Foxp3细胞线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential, MMP)和质量改变，研究人员探究Foxp3对Opa1、Drp1、Mfn1和Mfn2等线粒体动力学相关蛋白的作用，以明确其代谢模式的成因。双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)实验显示，在HEK293T细胞中Foxp3仅与Drp1存在相互作用（图2A），谷胱甘肽S-转移酶下拉(Glutathione S-transferase Pull-down Assay, GST pull-down Assay)实验加以验证（图2B）。构建融合蛋白观察到Drp1 定位于细胞质，Foxp3在细胞质和细胞核均有分布（图2C），二者在细胞质共定位，此现象经HEK293T细胞免疫荧光实验（图2D）以及以Tregs为对照的CAR-T细胞实验（图2E）证实。

研究Foxp3对Drp1磷酸化及线粒体的影响：已知Drp1丝氨酸616位点磷酸化促线粒体裂变，637位点磷酸化助融合。研究发现，Foxp3不影响Drp1表达及丝氨酸637位点磷酸化，却显著降低丝氨酸616位点磷酸化水平（图2F-M）。利用AlphaFold软件预测结构和对接结果表明，丝氨酸616位点磷酸化影响Foxp3与Drp1结合稳定性。显微镜观察显示，CAR-T_Foxp3细胞线粒体聚集伸长且数量少于CAR-T_Conv细胞（图2G-I）。此外，Foxp3对Drp1上游激酶CDK1和ERK1/2无明显抑制作用（图2M）。综合这些结果可知，Foxp3与Drp1结合可能影响Drp1磷酸化和线粒体裂变，进而重编程CAR-T细胞代谢。

确定Foxp3与Drp1结合位点及对代谢的影响：为确定Foxp3与Drp1结合位点及其对代谢的影响，研究人员利用薛定谔软件进行对接研究，筛选出5个结合稳定性最高的构象。通过构建多种Foxp3序列部分缺失质粒，BiFC实验发现缺失340-390位氨基酸片段会破坏二者相互作用。构建缺失该片段的CAR-T_{Foxp3(340-390)}细胞后，观察到其融合线粒体消失、线粒体数量恢复、脂滴含量降低，线粒体质量、MMP、ECAR和OCR增加（图2G-L），且Drp1丝氨酸616位点磷酸化增强（图2M）。研究还预测Foxp3的340-390片段与Drp1的600-620片段结合，构建缺失600-620片段的Drp1变体后，其BiFC平均荧光强度显著降低，表明该片段参与二者相互作用，解释了Drp1丝氨酸616位点磷酸化下调的原因（详情可查阅补充材料）。

综上，CAR-T_Foxp3细胞代谢重编程由Foxp3与Drp1结合介导。

3、CAR-TFoxp3细胞不会获得Tregs的染色质可及性和抑制功能

染色质可及性分析：研究人员利用ATAC-seq技术分析Tregs、CAR-T_Conv和CAR-T_Foxp3细胞全基因组染色质可及性，发现ATAC-seq峰主要集中于启动子、内含子和远端基因间区域，降维分析可清晰区分三类细胞（图3A）。转录起始位点(TSS)周围平均ATAC-seq信号显示，Tregs读数浓度低于其余两组，而CAR-T_Conv与CAR-T_Foxp3细胞信号相近（图3B）。深入分析发现，Tregs中显著升高的峰高度富集于TRPS1、RUNX2等转录因子识别基序，这些基序与Tregs的抑制功能相关。然而，在CAR-T_Foxp3细胞中，这些基序并不富集，表明二者染色质格局存在差异（图3C-E）。

细胞因子与标志物检测：检测T细胞相关标志物和细胞因子发现，与Tregs相比，CAR-T_Foxp3细胞分泌的IL-10、TGF-β水平较低，CTLA-4抑制性受体表达也降低，且与CAR-T_Conv细胞情况相近（图3F）。GPC3抗原刺激后，CAR-T_Foxp3、CAR-T_Conv和Tregs细胞中CD39和CD73表达无显著差异（图3F）。

抑制功能验证：通过共培养实验验证CAR-T_Foxp3细胞对T_Conv细胞增殖的抑制作用，结果显示CAR-T_Foxp3组中T_Conv细胞增殖明显强于Tregs组，与CAR-T_Conv组相近，表明CAR-T_Foxp3细胞无抑制作用。

差异峰与代谢物分析：研究发现，在CAR-T_Foxp3细胞上调、CAR-T_Conv细胞下调的峰中，仅有少量能在Tregs中共同富集（图3G-H）。通路富集分析表明这些峰集中于细胞代谢过程（图3I）。质谱检测发现，CAR-T_Foxp3细胞中乳酸、富马酸和NADH水平显著低于CAR-T_Conv细胞，或可解释CAR-T_Foxp3细胞染色质可及性与代谢相关的变化。

综上，CAR-T_Foxp3细胞在染色质格局和抑制功能上与Tregs存在根本差异，不会转化为Tregs。

4、Foxp3介导的代谢下调了CAR-T_Foxp3细胞中与耗竭相关的抑制性分子的表达

接下来，研究者探究了Foxp3介导的代谢对CAR-T_Foxp3细胞活化和功能的影响。

细胞表型与功能检测：将CAR-T_Foxp3和CAR-T_Conv细胞与GPC3⁺Huh7肿瘤细胞孵育72小时后，CAR-T_Foxp3细胞的CD27、CD28等活化及表型标志物和BCL-6转录因子水平更高，CD95、EOMES等水平更低（图4A-B）。细胞毒性评估表明，CAR-T_Foxp3细胞与CAR-T_Conv细胞杀伤能力相似（图4C） ，但前者释放的颗粒酶B、IFN-γ等细胞因子更少（图4D）。

耗竭标志物分析：GPC3抗原刺激72小时后，CAR-T_Foxp3细胞中PD-1、LAG-3等耗竭标志物表达及三重/双重阳性比例均低于CAR-T_Conv细胞（图4E-F）；经三轮抗原刺激后，第12天时CAR-T_Foxp3细胞耗竭分子减少、干细胞标志物CD62L增加，而CAR-T_{Foxp3(340–390)}细胞未维持该优势（图4G）。

机制探究：用P110处理增加Drp1丝氨酸616位点磷酸化后，CAR-T_Foxp3细胞耗竭标志物显著上升，CAR-T_Conv细胞无变化（图4H）；DCA处理或抑制脂肪酸β氧化，仅使CAR-T_Foxp3细胞耗竭标志物表达增加（图4I）。表明Foxp3与Drp1的相互作用、p-Drp1受损及Foxp3介导的代谢模式，共同作用下调CAR-T_Foxp3细胞耗竭标志物。

综上，Foxp3介导的代谢不影响CAR-T_Foxp3细胞毒性，但可下调其与耗竭相关的抑制性分子表达，对细胞功能调控具有重要意义。

5、CAR-T_Foxp3细胞在体内表现出强大的抗肿瘤活性，且耗竭标志物水平降低

通过小鼠皮下异种移植瘤模型及后续分子检测，证实CAR-T_Foxp3细胞在体内抗肿瘤能力更强且耗竭程度更低。

体内抗肿瘤效果验证：构建小鼠皮下肿瘤模型，在肿瘤体积约100mm³时（图5A），注射不同T细胞。结果显示，CAR-T_Foxp3细胞治疗组肿瘤生长最慢（图5B-C），肿瘤重量更轻（图5D），表明其具有更强的体内抗肿瘤活性 。

细胞表型与功能分析：第20天对肿瘤组织进行流式细胞术分析发现，与CAR-T_Conv细胞相比，CAR-T_Foxp3细胞CD28表达显著增加，PD-1、LAG-3、TIM-3等耗竭标志物明显降低（图5E-G），三重或双重阳性率也大幅下降（图5F）；共聚焦免疫荧光分析显示，CAR-T_Foxp3细胞中PD-1与CD3积分密度比值更低（图5H-I），进一步说明其耗竭程度低。

转录组水平探究：对肿瘤浸润的CAR-T细胞进行RNA-seq，主成分分析明确区分CAR-T_Foxp3与CAR-T_Conv细胞；CAR-T_Foxp3细胞中Foxp3持续高表达，TIM-3等耗竭相关基因显著下调（图5J），基因集富集分析证实其耗竭状态更低（图5K）。此外，转录组分析表明CAR-T_Foxp3细胞与Tregs存在根本差异，但部分上调基因在细胞代谢通路富集，提示二者代谢特征有相似之处（图5L）；同时，CAR-T_Foxp3细胞中线粒体相关通路显著富集，且Foxp3靶基因在两类细胞中的表达有差异。

综上，CAR-T_Foxp3细胞在体内展现出优于CAR-T_Conv细胞的抗肿瘤能力，且耗竭相关抑制性分子表达更低，在肿瘤免疫治疗中具有潜在优势。

6、Foxp3在体内使CAR-T_Foxp3细胞维持持久的抗肿瘤效果以及较低水平的耗竭标志物

肿瘤再攻击模型实验：当肿瘤体积达50mm³时（图6A），预先给予CAR-T细胞，CAR-T_Foxp3组肿瘤清除速度略快于CAR-T_Conv组（图6B）。肿瘤清除后，两组外周血CAR-T细胞计数无差异（图6C），但CAR-T_Foxp3组初始/干细胞记忆T细胞比例更高，终末效应记忆T细胞比例更低（图6D-E）。第29天再次用肿瘤细胞攻击，CAR-T_Foxp3组肿瘤生长最慢（图6F）。

验证Foxp3关键作用：将CAR-T_{Foxp3(340–390)}、CAR-T_Foxp3和CAR-T_Conv细胞注射到荷瘤小鼠（图6G），初期肿瘤均快速清除（图6H）。再次攻击后，CAR-T_{Foxp3(340–390)}组肿瘤生长速度与CAR-T_Conv组相似且快于CAR-T_Foxp3组（图6I），其TIM-3和LAG-3比例与CAR-T_Conv组相当且高于CAR-T_Foxp3组。

综上，CAR-T_Foxp3细胞增强的抗肿瘤效果及较低的耗竭相关抑制分子水平依赖于Foxp3的第340-390位残基，证实了Foxp3在CAR-T细胞抗肿瘤活性中的关键作用。

7、人源化NSG模型下CAR-TFoxp3细胞的双重特性——强抗癌、无免疫抑制

模型构建与细胞检测：使用CD34造血干细胞构建人源化NSG小鼠，在外周血和脾脏中检测到多种人类免疫细胞，外周血中人类免疫细胞(hCD45⁺)占总免疫细胞比例超60%，脾脏中人类免疫细胞占活细胞比例可达80%。

抗肿瘤效果：建立皮下异种移植瘤模型并给予不同CAR-T细胞治疗（图7A），CAR-T_Foxp3细胞显著抑制肿瘤生长，五只小鼠中有两只完全缓解，其余三只肿瘤大小也明显减小（图7B-C）。

细胞及因子分析：第25天分析显示，与CAR-T_Conv组相比，CAR-T_Foxp3细胞耗竭相关抑制分子（PD-1和LAG-3）水平更低，肿瘤浸润的CD4⁺T细胞更多（图7D-F）；两组肿瘤浸润的人类免疫细胞组成相似（图7F），小鼠脾脏重量和重要器官无显著差异（图7E）。多重细胞因子检测表明，CAR-T_Foxp3组中TNF-α和IL-10分泌量更低，细胞因子水平更稳定，IL-1β、IL-4等多种细胞因子平均水平低于CAR-T_Conv组，提示细胞因子风暴减轻，而对CAR-T细胞活化增殖关键的IL-2浓度两组无显著差异（图7G）。

综上，CAR-T_Foxp3细胞在人源化NSG模型中展现出增强的抗肿瘤活性，同时维持安全性，未诱导免疫抑制。

本研究围绕CAR-T_Foxp3细胞的抗肿瘤作用展开深入探究。通过构建小鼠皮下异种移植瘤模型、肿瘤再攻击模型以及人源化NSG小鼠模型，从多维度验证了CAR-T_Foxp3细胞的特性。在小鼠皮下异种移植瘤模型中，CAR-T_Foxp3细胞肿瘤抑制效果显著，细胞耗竭程度低，且在转录组水平展现出独特的基因表达模式。肿瘤再攻击模型证实其抗肿瘤作用的持久性，且该效果依赖于Foxp3的第340-390位残基。在人源化NSG模型中，CAR-T_Foxp3细胞不仅能有效抑制肿瘤生长，实现部分小鼠肿瘤完全缓解，还能维持较低的耗竭标志物水平，减轻细胞因子风暴 ，且不诱导免疫抑制，同时对其他免疫细胞组成及小鼠重要器官无不良影响。这些结果表明，CAR-T_Foxp3细胞在体内具有优异的抗肿瘤活性和良好的安全性，为肿瘤免疫治疗提供了新的潜在策略和理论依据。